Versuch RT-PCR
Wozu dieser Versuch?
Die Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine der zentralen Techniken der modernen Biologie. Grund: mit dieser Methode kann man jede DNS, deren Sequenz (wenigstens teilsweise) bekannt ist, künstlich vervielfältigen. Die Entwicklung der PCR hat eine kuriose Geschichte: bereits in den 1970er Jahren hatte Kjell Kleppe die Idee DNA mit zwei flankierenden Primern zu amplifizieren. Seine Methode geriet jedoch in Vergessenheit und wurde von Kary Mullis neu entdeckt, der 1993 den Nobelpreis dafür erhielt. Die PCR ist heute eine Standardmethode in jedem Molekularbiologielabor. Routinemäßig wird sie beispielsweise eingesetzt:
- im medizinischen Bereich zur Erkennung von Krankheiten
- zur Erstellung genetischer Fingerabdrücke
- in der Molekularbiologie zur Klonierung von Genen oder zur Mutagenese
- bei Vaterschaftstests
- zur Analyse fossiler DNS
- zur Untersuchung der Genexpression
Bei der PCR werden die folgenden Komponenten benötigt:
- eine Ausgangs DNS (Matrize, Template), die vervielfältigt werden soll
- zwei Primer, die den zu vervielfältigenden Bereich eingrenzen
- eine hitzestabile DNS-Polymerase, die die Matrize kopieren kann
- Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs), die als Bausteine für die neu zu synthesierende DNS dienen
- Mg2+-Ionen, als Co-Faktor für die DN-Polymerase
- ein Puffer, der das geeignete chemische Milieu bietet
Eine Standard-PCR-Reaktion besteht aus 3 Schritten: Denaturierung, Annealing und Elongation. Bei der Denaturierung werden die beiden Stränge der DNA durch hohe Temperatur (94°C) getrennt. Ein wichtiger Punkt für die erfolgreiche PCR ist die Wahl der Primer. Sie sollten zwischen 20 und 30 Nukleotide lang sein und in einem Temperaturbereich von 50-65°C mit der DNA hybridisieren (Annealing). Wichtig ist auch das Verhältnis der dNTPs: Desoxyguanosintriphosphat (dGTP) + Desoxycytidintriphosphat (dCTP) und Desoxyadenosintriphosphat (dATP) + Desoxythymidintriphosphat (dTTP) sollten etwa in einem Verhältnis von 1:1 in der Primersequenz vorkommen. Die DNA-Polymerase verlängert bei einer Temperatur von 72°C die Primer von 5’- in 3’-Richtung (Elongation). Dabei werden dNTPs eingebaut, die komplementär zum Matrizenstrang sind. Anschließend wird die DNA wieder geschmolzen (Denaturierung).
Man kann PCR entweder mit genomischer DNS durchführen, man kann aber auch mRNS (Transkripte) durch reverse Transkriptase (RT) in cDNS umschreiben und diese dann über eine PCR vervielfachen. Wenn man die PCR-Produkte (Amplifikate) dann auf dem Gel auftrennt, erhält man je nach Ausgangsmenge des entsprechenden Transkripts eine starke oder eine schwache Bande. Man kann damit also die Menge von Transkripten und damit die Genexpression messen. Genau das wird in diesem Versuch vermittelt. Andere Methoden, die Genexpression zu messen, ist der sogenannte Northern Blot, wo man mRNS auf einem Gel auftrennt und (analog zum Western Blot, wo man Antikörper benutzt) und dann mit einem markierten komplementären cDNS Stück (der sogenannten antisense-Sonde) nachweist. Der Northern Blot wird jedoch aufgrund seiner aufwendigen Durchführung nur noch selten angewandt, erlaubt es aber, mithilfe von internen Standards die Genexpression zu messen. Hierfür setzt man inzwischen jedoch eine andere PCR-basierte Methode, die qPCR (q steht für quantitative) oder auch real-time PCR. Das ist im Grunde eine PCR mit fluoreszent markierten Nucleotiden, wobei man nicht das Endprodukt auf einem Gel aufträgt, sondern nach jedem Zyklus über die Fluoreszenz ausliest, wieviel Amplifikat gebildet wurde. Je nach Ausgangsmenge steigt die Kurve verschieden schnell an und aus diesem Zeitverlauf kann man die Ausgangsmenge des entsprechenden Transkripts berechnen.