Vorlesung Fluoreszenzmikroskopie

Fluoreszenzmikroskopie - eine Schlüsseltechnologie der modernen Biologie

Bis in die 80er Jahre hinein war Fluoreszenzmikroskopie eine mikroskopische Spezialtechnik, mit der sich nur ein paar Exoten beschäftigten. Inzwischen bringen die einschlägigen Hersteller fast jedes Jahr komplett neue Geräte auf den Markt und Fluoreszenzmikroskopie ist aus der modernen Biologie nicht mehr wegzudenken. Was ist geschehen?

Während man ursprünglich nur einige wenige, sehr spezielle Moleküle aufgrund ihrer Eigenfluoreszenz beobachten konnte, brachte die  Immunfluoreszenz den Durchbruch. Hier konnte man nun im Prinzip für jedes beliebige Molekül mithilfe der entsprechenden Antikörper feststellen, wo es in der Zelle lokalisiert war. Das steigerte die Nachfrage nach Fluoreszenzmikroskopen ungemein und führte zu einem Schub bei der technologischen Entwicklung. Dies verstärkte sich dann noch, als es mithilfe der Fluoreszenten Proteine gelang, um Proteine von Interesse auch in lebenden Zellen zu beobachten. Inzwischen nutzt man auch relativ abgefahrene optische Effekte wie evaneszente Wellen und Interferenzen zwischen Lasern, um die durch die Abbésche Formel beschriebene magische Auflösungsgrenze von etwa 200 nm zu knacken und lichtmikroskopisch in Größenbereiche vorzudringen, die früher nur über Elektronenmikroskopie zugänglich war.

Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie: Dies ist die Grundform der Fluoreszenzmikroskopie wie sie inzwischen weltweit in zahllosen Labors eingesetzt wird. Das Licht wird dabei nicht wie bei der Hellfeld-Mikroskopie von unten (als sogenannte Durchlichtmikroskopie), sondern durch das Objektiv von oben (als sogenannte Auflichtmikroskopie) auf das Präparat gestrahlt. Der Grund: beim Weg durch das Präparat wird so viel Licht geschluckt, dass bei einer Durchlichtvariante nichts mehr im Auge ankäme. Möglich wurde Auflichtfluoreszenzmikroskopie (Epifluoreszenzmikroskopie) erst durch die Erfindung von sogenannten Farbteilern, die abhängig von der Wellenlänge das Licht reflektieren oder passieren lassen, also das Licht in Farben teilen. Das (kurzwellige) Anregungslicht kann so seitlich in den Strahlengang eingespiegelt werden und gelangt durch das Objektiv auf das Präparat. Das aufgrund der Stokes-Shift langwelligere Fluoreszenzlicht, das vom Präparat zurückkommt, wird hingegen durchgelassen.

Konfokalmikroskopie: Vor allem seit der Einführung der Fluoreszenten Proteine wird Fluoreszenzmikroskopie immer stärker an lebenden Zellen oder gar Organismen durchgeführt. Hier hat man nun das Problem, dass das fluoreszente Licht der Struktur, die man im Fokus hat, überstrahlt wird durch Licht aus den Regionen unterhalb oder oberhalb der Fokusebene. Die Konfokalmikroskopie ist eine Weiterentwicklung der Fluoreszenzmikroskopie, bei der dieses Licht, das ja keine wirkliche Information liefert, weggefiltert wird. Dies geschieht  über eine sogenannte konfokale Lochblende (pinhole), die das nichtfokussierte Licht, das mit einem weiteren Winkel eintrifft (klassische Konfokale Laser-Rastermikroskopie, CLSM für confocal laser scanning microscopy) abhält. Alternativ wird bei der sogenannten Apotomie ein bewegtes optisches Gitter in die Fokusebene projiziert. Signale aus der Fokusebene ändern daher ihre Intensität, Signale von ausserhalb der Fokusebene ändern ihre Intensität nicht. Solche invarianten Signale werden dann weggefiltert, so dass ein konfokales Bild entsteht.

Neue Entwicklungen: Seit etwa fünf Jahren beobachtet man eine förmliche Explosion neuer Techniken und auch Geräte. Dabei geht es darum, die Auflösung in z- und in xy-Ebene zu verbessern. Verschiedene Techniken der strukturierten Beleuchtung erlauben es, über Interferenzen Intensitätsunterschiede zu erzeugen, die weit enger sind als die Wellenlänge des sichtbaren Lichts. Stimulated emission-depletion (STED) oder 4p-Mikroskopie zählen hier dazu. Durch Nutzung von optischen Effekten mit sehr geringer Reichweite (z.B. die Bildung sogenannter evaneszenter Wellen bei der Totalreflexion) kann man auch in z-Richtung nur ganz schmale Schichten anregen und damit Signale aufnehmen, die bis auf Einzelmolekülebene hinunterreichen. Das oben erwähnte Apotom ist im Grunde der Prototyp für diese Entwicklung der strukturierten Beleuchtung.

Fragen zum Nachdenken

1. Beschreiben Sie stichwortartig, wie Sie mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops Protein-Dynamik untersuchen würden

2. Erläutern Sie zwei Verfahren, mit denen man die Auflösungsgrenze in lebenden Zellen durchbrechen kann.

3. Sie wollen Mikrotubuli in einem grünen Blatt über Immunfluoreszenz beobachten. Welches Fluorochrom wählen Sie? Warum?

4. Berechnen Sie die Auflösungsgrenze für eine FITC Fluoreszenz (100 x Objektiv, Öffnungswinkel 83°). Wie ändert sich die Auflösungsgrenze, wenn Sie Immersionsöl einsetzen?