Vorlesung Fluoreszente Marker

Fluoreszente Marker - Schlüsselmoleküle für die moderne Biologie

Lange Zeit war Zellbiologie eine strukturelle Wissenschaft - es ging darum, wie etwas aufgebaut ist. Die molekularen Aspekte der Zellbiologie waren nur ansatzweise untersuchbar. Fluoreszente Marker erlauben es, spezifisch ein Molekül von Interesse in der Zelle nachzuweisen. Dies führte ab den 80er Jahren zu einer Revolution, weil nun Molekularbiologie / Biochemie nun unter dem Mikroskop betrieben werden konnten.  Fluoreszente Marker sind zu einem der zentralsten Werkzeuge der modernen Biologie geworden und werden tagtäglich in unzähligen Labors eingesetzt. Warum?

Nachdem inzwischen die Genome wichtiger Modellorganismen (Maus, Hefe, Drosophila, Caenorhabditis, Arabidopsis, Reis…) durchsequenziert wurden, geht es im inzwischen angebrochenen „postgenomischen Zeitalter" darum, die Funktion all dieser unzähligen Gene zu verstehen. Hierbei sind zwei Fragestellungen wichtig:

A. Wo wird ein bestimmtes Gen exprimiert (also in welchen Zellen?)

B. Wo ist ein bestimmtes Protein in der Zelle lokalisiert?

Vor allem in Verbindung mit dreidimensionalen Mikroskopiertechniken (konfokale Laser-Raster-Mikroskopie, Apotom) können auch dicke Präparate (beispielsweise intakte Organe oder gar ganze Lebewesen) beobachtet werden.

Fluoreszente Marker gliedern sich in drei Gruppen:

A. Organische Fluorochrome, also fluoreszente Farbstoffe, die aufgrund chemischer Spezifitäten bestimmte Zellbestandteile färben (Beispiel: fluoreszentes Phalloidin, mit dem man Actinfilamente färben kann).

B. Antikörper, die man direkt oder indirekt fluoreszent markieren kann, so dass man beobachten kann, wo das entsprechende Antigen in der Zelle vorliegt. Dieses Verfahren heißt Immunfluoreszenz und ist Thema eines eigenen Versuchs. Mehr zur Immunfluoreszenz.

C. Fluoreszente Proteine, die über genetic engineering (also nur mithilfe einer Transformation!) als Marker in lebenden Zellen einsetzbar sind und dafür genutzt werden, entweder die Aktivität eines Zielpromotors zu verfolgen oder in Form einer Fusion mit einem Protein von Interesse die Lokalisation dieses Proteins zu verfolgen. Auch diese Einsatzmöglichkeiten sind Thema eines eigenen Versuchs. Mehr zu Fluoreszenten Proteinen.

Fragen zum Nachdenken

1. Nennen Sie drei für die zellbiologische Praxis wesentlichen Eigenschaften von GFP.

2. In einem Experiment wollen Sie Actinfilamente in fixierten Pflanzenzellen sichtbar machen. Welche der folgenden Substanzen wählen Sie dazu aus: a) Acridin Orange, b) DiOC, c) FITC-Phalloidin. Begründen Sie Ihre Entscheidung.

3. Es gibt GFP-Formen, die speziell für die Expression in Pflanzen, andere, die für die Expression in Säugerzellen entwickelt wurden. Was ist der Grund und worin unterscheiden sich diese Formen?

4. Sie untersuchen die Verteilung des Transkriptionsfaktors in der Zelle dadurch, daß sie eine Fusion dieses Faktors mit GFP unter Kontrolle des 35S Promotors exprimieren. Sie beobachten wie erwartet eine Fluoreszenz im Kern, aber zusätzlich eine starke Fluoreszenz im Cytoplasma. Deuten Sie diesen Befund.

5. Was ist Aequorin? Zählt es zu den fluoreszenten Proteinen?