Versuch GFP

Wozu dieser Versuch?

2008 bekamen drei Biologen den Nobelpreis für Medizin - Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien. Damit wurden ihre Arbeiten zu Fluoreszenten Proteinen anerkannt. Wenn drei Biologen den Medizin-Nobelpreis bekommen, weil sie sich mit einem doch recht exotischen Protein aus Quallen befasst haben, das mit dem Meeresleuchten zu tun hat, ist das zunächst erst einmal verwunderlich. Die Entscheidung des Nobelpreis-Komittees war aber unumstritten; denn diese fluoreszenten Proteine sind zu einem der zentralsten Werkzeuge der modernen Biologie geworden und werden tagtäglich in unzähligen Labors eingesetzt. Warum?

Ähnlich wie bei der Immunfluoreszenz, sind Fluoreszente Proteine Werkzeuge, um die Lokalisation von Proteinen bestimmen zu können. Außerdem kann man mit Fluoreszenten Proteinen auch den Genen bei der Arbeit zuschauen, wenn man sie nämlich als sogenannte Reporter für die Aktivität eines Promotors von Interesse einsetzt. Nachdem inzwischen die Genome wichtiger Modellorganismen (Maus, Hefe, Drosophila, Caenorhabditis, Arabidopsis, Reis…) durchsequenziert wurden, geht es im inzwischen angebrochenen „postgenomischen Zeitalter" darum, die Funktion all dieser unzähligen Gene zu verstehen. Hierbei sind zwei Fragestellungen wichtig:

1. Wo wird ein bestimmtes Gen exprimiert (also in welchen Zellen?)

2. Wo ist ein bestimmtes Protein in der Zelle lokalisiert?

Fluoreszente Proteine sind für beide Fragestellungen sehr wichtige Werkzeuge. Vor allem in Verbindung mit dreidimensionalen Mikroskopiertechniken (konfokale Laser-Raster-Mikroskopie, Apotom) können auch dicke Präparate (beispielsweise intakte Organe oder gar ganze Lebewesen) beobachtet werden. Bevor man die fluoreszenten Proteine jedoch beobachten kann, müssen die entsprechenden Konstrukte erst in die Zelle eingeführt werden, man muss also immer transgene Organismen herstellen (im Gegensatz zur Immunfluoreszenz, wo man das nicht tun muss). Die Transformation kann entweder stabil erfolgen oder aber nur vorübergehend (transient). Für die stabile Transformation wird bei Pflanzen häufig Agrobacterium als Vehikel verwendet. Alternativ kann die DNS über Partikelbombardement eingebracht werden (sogenannte Biolistik).

Fluoreszente Proteine als Reporter für Promotoraktivität: Hierfür muss man stabil transformierte Zell-Linien einsetzen. Die Herstellung solcher Linien ist oft sehr zeitaufwendig. Dabei wird der Promotor, dessen Aktivität man verfolgen möchte, vor GFP kloniert und dieses Konstrukt dann stabil in den Zielorganismus eintransformieren. Immer dann, wenn der Promotor angeschaltet wird, entsteht also GFP. Die Stärke der GFP-Fluoreszenz zeigt also die Aktivität des Promotors an.

Fluoreszente Proteine als Reporter für innerzelluläre Lokalisierung: Hierbei wird für das Protein, dessen Lokalisierung man untersuchen möchte, ein cDNS-Fusionskonstrukt mit GFP erzeugt und hinter einen starken, immer aktiven Promotor kloniert. Bei Pflanzenzellen wird in der Regel der 35S-Promotor des Cauliflower Mosaic Virus (CaMV-35S) benutzt. Natürlich kann man auch hier wieder stabil transformierte Zellen herstellen. Für viele Fragestellung genügt es jedoch, wenn die eintransformierte DNS nur für eine gewisse Zeit aktiv ist. Man kann daher auch mit transienter Transformation arbeiten.