Plant Cell Biology 2022
The Hainan Head Yew (Cephalotaxus hainanensis) belongs to the rarest trees on our planet. Only a few hundred individuals are left and have to be guarded, because people come at night to steal the bark, which is traded with eight times the price of gold. The reason are specific alkaloids, the harringtonines that are the most potent anti-leucemia compounds known. Would plant cell fermentation be an alternative? The entire transcriptome could be constructed in 2014 and based on this the pathway for harringtonine biosynthesis is currently constructed in a cooperation with the group of Dr. Fei Qiao in the Chinese Academy for Tropical Agriculture, Hainan. The early pathway leading to the scaffold of the phenylisoquinoline alkaloids has been constructed and the genes involved have been cloned. M. Sci. Nasim Reshadinejad has generated tobacco lines overexpressing those, and now we try to play "metabolic LEGO", combining different transgenic cell types to test, whether this yields the compounds predicted by the one or the other hypothesis. The project deals with the first two steps, where the amino acid phenylalanine is converted to cinnamonic acid and this further to coumaric acid. The efficiency of this pathway is crucial to suppress a shunt pathway leading to the monolignol precursor ferulic acid driven by the endogenous tobacco enzyme C3H. To tailor this, we need to know, how the two cell types interact during co-cultivation. Nasim has generated the two enzymes as fusions with fluorescent proteins of different colour, such that one can study their "ecological behaviour", either under control conditions and after precursor feeding. Scriptum with protocols . work on the Cephalotaxus transcriptome .
Metabolisches LEGO
Wohin wollen wir? Wertgebende Stoffe aus Pflanzen.
Pflanzen bilden nach neuesten Schätzungen etwa eine Million spezifische Sekundärmetabolite. Viele dieser Metabolite haben die biologische Funktion, die Wechselwirkung mit anderen Organismen zu steuern und sind daher häufig pharmazeutisch aktiv. Viele dieser oft kostbaren und teuren Inhaltsstoffe können nicht synthetisch hergestellt und müssen daher aus ihrer natürlichen Quelle extrahiert und aufgereinigt werden. Die zugrundeliegenden Stoffwechselwege sind komplex und erfordern das Zusammenwirken verschiedener Zelltypen, bis der Wirkstoff in spezialisierten, oft einzelnen, Exkretzellen eingelagert wird. Dies macht die Extraktion häufig mühsam und wenig ertragreich, außerdem sind viele dieser Pflanzen selten und bedroht. Beispielsweise wurde die Pazifische Eibe durch die Entdeckung, dass Taxol Krebszellen hemmt, an den Rand der Ausrottung gebracht. Biotechnologische Ansätze wären hier eine Alternative.
Molecular Farming – Potential und Limitierung.
Vor allem in Situationen, wo kleine Mengen eines wertvollen Produkts erzeugt werden, ist Grünes Molecular Farming kostengünstiger als andere Systeme wie transgene Tiere oder Mikroorganismen. Da in geschlossenen Systemen gearbeitet wird, lassen sich die in Europa kontrovers diskutierten Aspekte einer GVO-Freisetzung vermeiden. Der Schwerpunkt liegt momentan noch auf proteinbasierten Komponenten, die Erzeugung von Sekundärmetaboliten spielt nur eine marginale Rolle. Das liegt nicht an Mangel an Interesse – die Synthese des Antikrebs-Wirkstoffs Vinblastin in Zellkulturen von Catharanthus roseus wird seit inzwischen einem halben Jahrhundert verfolgt mit sehr bescheidenen Ergebnissen. Eine Limitierung für Molecular Farming ist die oben erwähnte Kompartimentierung des Sekundärstoffwechsels auf verschiedene Zelltypen was sich in einem typischen Biofermenter nicht reproduzieren lässt. Die Erzeugung wertgebender pflanzlicher Sekundärstoffe setzt voraus, dass Zelltypen mit unterschiedlichen metabolischen Leistungen über einen Fluß gekoppelt werden.
Der neue Ansatz – modulare Mikrofluidik.
Unsere Idee setzt genau hier ein. Im Grunde wollen wir ein Pflanzengewebe technisch nachbilden. Dazu setzen wir nicht auf einen üblichen Fermenter, sondern auf ein Mikrofluidiksystem, das zwischen unterschiedliche Zelltypen, die jeweils unterschiedliche metabolische Leistungen vollbringen, einen metabolischen Fluß herstellt. Das Produkt soll dann im Durchfluss aufgefangen werden. Durch den modularen Aufbau lassen sich auch unterschiedliche Kombinationen erzeugen, die zu unterschiedlichen Wirkstoffen (auch Derivate, die natürlicherweise in der Pflanze gar nicht vorkommen) führen. Ein metabolisches Modul besteht dabei aus Zellen, bei denen über genetic engineering jeweils ein metabolisches Schlüsselenzym überexprimiert ist. Als Modell für den proof-of-principle wählen wir den Flavonoid-/Stilben-Weg (Erzeugung des gegen Krebszellen hochpotenten Aglykons Quercetin) der Weinrebe, den Alkaloid-Weg von Tabak (Erzeugung des anti-Alzheimer-Wirkstoffs Nornicotin) und den Alkaloid-Weg der Schlafbeere Withania (Erzeugung von Withanoliden, mit hohem Potential gegen Parkinson).
Wo stehen wir?
Gemeinsam mit der Arbeitsgruppe Dr. Guber, Institut für Mikrostrukturtechnik (KIT-CN) wurde in einem mehrjährigen Prozess ein mikrofluidischer Biofermenter entwickelt und zum Patent eingereicht, in der Zellen der Tabaklinie BY-2 über längere Zeit kultiviert werden können. Das System wurde so optimiert, dass die biologische Funktionalität der Pflanzenzellen vollständig erhalten bleibt und im Durchfluss abhängig vom Entwicklungszustand der Zellen unterschiedliche Sekundärmetaboliten geerntet werden können.